质粒DNA（pDNA）作为mRNA疫苗和病毒载体的核心原料，正站在抗击癌症、心血管疾病、免疫系统疾病及传染病的前沿。为充分释放其治疗潜力，惠及更多患者，提升生产效率至关重要。其中，质粒DNA的生产是关键瓶颈——传统方法不仅产率低，还依赖复杂的纯化工艺，制约了整体工艺的规模化与可持续发展。
质粒的不同拓扑形态
·超螺旋质粒 (supercoiled, sc pDNA) ：又叫共价闭环双链DNA (ccc DNA) ，是双链DNA在旋转酶gyrase的催化下，像扭麻花一样将自身缠绕形成（负）超螺旋，结构紧凑，利于在细胞的狭小空间内存储大量遗传信息。sc pDNA完整、稳定、有活性，转染效率高。
·开环质粒 (open circular, oc pDNA) ：如果sc pDNA的一条链发生断裂，即为oc pDNA，由细菌生长过程中自然发生、UV照射、核酸酶催化断裂、或提取等过程的机械损伤造成，并受到纯化后储存温度的影响。失去超螺旋缠绕结构，形态松散。oc pDNA经过内切酶处理，可以变为线性pDNA。
·线性质粒 (linear pDNA) ：sc pDNA的两条链在相邻位置发生断裂，或者经过限制性内切酶酶切，即为linear pDNA。
·寡聚 (oligomer) 形式的串联体 (concatemer) ：可以发生在上述三种结构中，整个pDNA为一条链，酶切行为与单体一致。通常出现在质粒复制后的同源重组过程或复制过程当中。pDNA的插入片段越大，则寡聚-单体比例越高。
工艺挑战与对策
质粒DNA（pDNA）的纯化面临诸多挑战：目标产物在大肠杆菌裂解液中仅占约3%，且多数杂质与pDNA具有相似的负电荷和分子大小，分离难度大。同时，最终超螺旋pDNA的纯度需满足监管要求（>90%），对工艺的分辨率与可控性提出了更高标准。
pDNA对剪切力极为敏感，在浓缩等操作中易发生结构损伤，导致拓扑形态改变，影响产品质量。因此，减少切向流超滤等高剪切步骤，有助于保持其结构完整性和高纯度。
传统层析填料在pDNA纯化中亦存在局限：由于pDNA分子远大于蛋白质，难以进入填料微孔，导致结合载量低、传质效率差；高进料粘度和潜在污染还易引起柱压升高、处理时间延长。尽管存在诸多不足，目前大规模纯化仍主要依赖填料工艺。为此，越来越多的pDNA生产商正转向对流介质（如膜吸附器、整体柱等），以提升色谱步骤的效率与产能，推动工艺升级。
此外，不同质粒在设计及表达过程中差异显著。部分因结构设计缺陷或裂解工艺控制不当，易导致开环质粒比例偏高，难以通过XQ一步法（cobetter Pultrix XQ膜一步法https://mp.weixin.qq.com/s/nvGoOdRupsgw7KbT9AhkhQ）实现超螺旋率>90%的目标；若表达量过低，也可能导致宿主细胞DNA（HCD）残留无法控制在1%以内。针对此类情况，建议引入第二步层析纯化，进一步提升超螺旋纯度并有效去除宿主杂质，确保产品质量全面达标。
Cobetter Pultrix™ PS 以二巯基吡啶为功能化配基，利用其含氮芳香环与硫醚结构，与超螺旋质粒产生特异性的嗜硫亲和作用，实现高效选择性纯化。同时，配基的疏水特性可进一步去除宿主相关杂质，提升纯化效果。
该产品创新性地采用PES膜作为层析基质，凭借膜材料的大孔结构，显著提高对质粒大分子的结合载量；结合膜层析独特的对流传质机制，传质效率远超传统柱层析。纯化步骤由传统方法的单步约2小时缩短至仅20分钟，大幅提升了小试工艺开发与规模化生产的效率，为质粒纯化提供了快速、高效、可放大的解决方案。
Pultrix™系列PES基膜电镜照片
1671金沙城线路检测案例分享
设备及耗材信息
层析Buffer信息
样品处理
将Pultrix™ XQ膜洗脱液使用Buffer D将(NH4)2SO4终浓度调节至2.2M(NH4)2SO4，使用Pultrix™ PS膜（MV：0.2 mL），按下表中实验条件进行实验：
由于小试膜体积较小，层析系统死体积影响较大，故方法设置体积偏大，按峰收集后取样跑胶、测浓度、HPLC以及各项杂质检项。
结果
琼脂糖凝胶电泳结果显示，Pultrix™ XQ膜洗脱样经过Pultrix™ PS膜后，开环质粒在洗杂步骤中大量去除，洗脱液中超螺旋质粒比例明显提升。
杂质残留结果
Pultrix™ PS膜吸附器（层析）精纯收率70%左右，超螺旋pDNA比例从89.1%提升至96.4%，各项杂质残留均得到有效控制。
值得注意的是经过多个项目的头对头对比测试，相较于传统三步法最终产品的杂质残留，Cobetter质粒膜层析纯化两步法的杂质残留更低。
1671金沙城线路检测质粒纯化解决方案
成本、效率的比较：填料VS膜
质粒膜吸附器一步法与传统三步法纯化成本对比
以1 KG菌体裂解规模为例（质粒产量：4 mg/g）；裂解后澄清液体积：45 L；质粒浓度0.089 mg/ml
1671金沙城线路检测作为中国高端过滤与纯化技术企业，不仅提供全球先进的膜过滤耗材与硬件产品，更致力于构建覆盖工艺开发、设备集成到验证支持的全链条解决方案，助力客户突破产业化关键瓶颈。
